TECHNIQUES DE SEPARATION DES CONSTITUANTS D'UN MELANGE
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Solutions pour chromatographie et électrophorèse
I / GENERALITES :
1 / Définition :
La chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les différences d'affinité des substances à analyser à l'égard des deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase mobile résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successives sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité dans chaque phase.
L'adsorption est un phénomène de surface qui consiste en la formation de liaisons entre les molécules ( ou atomes ) d'un composé et celles de la surface adsorbante. L'adsorption est un phénomène de pénétration d'un composé à l'intérieur d'un autre.
2 / Nature des phases:
Phase fixe :
La phase fixe peut être solide ou liquide :
Les solides, silice ou alumine traitées, permettent la séparation des composants des mélanges grâce à leur propriétés adsorbantes. Ils peuvent être employés comme remplissage d'une colonne ( chromatographie par gravité et chromatographie à haute pression ) ou étalée en couche mince sur une plaque de verre, d'aluminium ou sur une feuille de matière plastique (chromatographie sur couche mince ).
Un liquide imprégne un support solide ou encore une chaîne carbonnée fixée chimiquement à son support ( phase greffée ). Ainsi, en chromatographie sur papier, la phase fixe est formée par l'eau que les molécules de cellulose du papier adsorbent, alors qu'en chromatographie en phase gazeuse, elle est constituée d'un liquide peut volatil et thermiquement stable imprégnant un granulé poreux.
Phase mobile :
La phase mobile est soit un gaz ( gaz vecteur ou gaz porteur ), soit un liquide ( éluant ou plus rarement solvant).
3 / Nature des phénomènes :
Chromatographie d'adsorption : la phase stationnaire est un adsorbant et la séparation est basée sur l'adsorption séléctive des composants d'un mélange à la surface du solide
Chromatographie de partage : la phase stationnaire est un liquide adsorbé à la surface d'un support solide inerte ; la séparation repose sur les différences de solubilité des composants dans la phase liquide.
Chromatographie d'échange d'ions : la phase stationnaire est un solide, ionisé ou ionisable, dont les ions sont échangeables avec ceux de la phase mobile. La séparation est fondée sur le fait que plus la charge ionique des composants est élevée, plus la rétention à la surface du solide est importante. La phase mobile est habituellement une solution tampon dont le pH permet de contrôler la mobilité des composants du mélange analysé.
Chromatographie d'exclusion ( ou de filtration sur gel ou de perméation ): la phase stationnaire est constituée d'un solide présentant une multitude de pores dont la dimension est de l'ordre de la taille des molécules les plus petites à analyser. La séparation résulte du fait que les grosses molécules ne peuvent pénétrer dans les pores alors que les petites sont retenues plus ou moins longtemps. La méthode s'applique également à la séparation de molécules de polymères, en fonction de leurs masses moléculaires.
II / CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE :
1 / Chromatographie sur couche mince
2 / Un exemple : identification des acides aminés constitutifs d'une protéine
III / CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER :
1 / Principe :
La chromatographie sur papier est une méthode de séparation dont le principe repose surtout sur des phénomènes de partage. La phase mobile est le plus souvent un solvant organique et l'eau ; la phase stationnaire est constituée par l'eau elle même, adsorbée par la cellulose du papier ou liée chimiquement à elle. Comme en chromatographie sur couche mince, l'échantillon, mis en solution, est déposé en un point repère du papier et le solvant qui se déplace par capillarité fait migrer les composants de l'échantillon à des vitesses variables selon leur solubilité. Généralement, les composés les plus solubles dans l'eau ou ceux qui forment facilement des associations par liaisons hydrogène sont fortement retenus par la phase stationnaire et migrent donc lentement.
Losque l'eau est un des solvants de la phase mobile, le ou les solvants organiques doivent y être assez solubles. C'est pourquoi, des produits comme l'acide éthanoïque, le propanol, le phénol, ou la pyridine sont les solvants les plus fréquemment mélangés avec l'eau pour développer un chromatogramme.
La chromatographie sur papier est employée principalement pour l'analyse de composés très polaires, tels que les acides aminés, les sucres et les composés polyfonctionnels. Ses plus grands inconvénients par rapport à la chromatographie sur couche mince sont :
- une durée de développement beaucoup plus longue
- une séparation généralement moins bonne.
2 / Papier
On peut employer du papier filtre ordinaire, mais il est préférable de se procurer du papier conçu pour cet usage, ayant un faible taux d'impuretés et dont les caractéristiques physiques sont uniformes.
Les marques principales sont Whatman, Schleider et Schüll, Durieux, Arches. Il existe huit catégories de papier Whatman, classés selon leur épaisseur, la texture de leur surface et la vitesse avec laquelle l'eau y diffuse. Par exemple, le papier Whatman n°1 est le plus utilisé, mais si on désire une grande vitesse d'écoulement, on emploiera le n°4 ; le papier n°20 est très lent, mais il permet une meilleure séparation, donnant les taches très denses et uniformes.
3 / Séparation des pigments foliaires par chromatographie sur papier
L'ELECTROPHORESE
I / GENERALITES
1 / Définition :
Des particules ayant une charge électrique nette et soumises à l'action d'un champ électrique se déplacent dans la direction du champ vers le pôle de signe opposé à leur charge, à une vitesse proportionnelle à cette charge. Cette opération, s'appliquant à un ensemble hétérogène de particules chargées, entraîne la séparation de ces particules : c'est une séparation électrophorétique ou électrophorèse.
On peut en définir plusieurs types :
2 / Les différents types d'électrophorèse :
- L'électrophorèse libre :
La migration s'effectue au sein d'un liquide de composition déterminée. Elle est dite également électrophorèse en veine liquide ou encore électrophorèse de frontières. Les particules ne se séparent pas complèteemnt mais il se forme des frontières mises en évidence par des méthodes optiques telles que l'absorption ultra-violette pour les protéines.
- L'électrophorèse de zones :
La migration est réalisée également dans une phase liquide mais celleci s'imprègne un milieu solide poreux ou un milieu gélifié. Les supports les plus utilisés sont le papier, l'acétate de cellulose et les gels de gélose et d'agarose, d'amidon, de plyacrylamide et d'agarose-acrylamide.
- L'électrophorèse analytique :
Elle a pour but la séparation du plus grand nombre possible de constituants d'un mélange. Les supports souvent utilisés sont les gels d'amidon, de polyacrylamide et d'acrylamide-agarose, gels possédant les propriétés filtrantes qui permettent de séparer les particules non seulement en fonction de leur charge électrique mais aussi de leur taille.
- L'électrophorèse préparative :
Elle a pour but d'obtenir des quantités plus ou moins importantes d'un ou plusieurs constituants d'un mélange ; aussi le rendement de l'opération doit il être pris en considération aux dépens de la finesse de la séparation. Les supports utilisés sont la cellulose, la poudre d'amidon et les gels d'acrylamide.
II / ELECTROPHORESE DE ZONES : PRINCIPE
Une particule chargée soumise à un champ électrique continu se déplace avec une vitesse v qui est la somme de trois composantes, vE qui représente la vitesse électrophorétique dirigée vers l'anode, ve qui symbolise la vitesse du courant
III / ELECTROPHORESE DE ZONES : EXEMPLE
