TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE
A/ Stérilisation par la chaleur :
I / Chaleur sèche ( oxydation des protéines ):
- Effectuer trois ou quatre passages lents des objets à stériliser dans la flamme bleue du bec Bunsen afin de détruire à sa surface toute matière organique
- A utiliser pour les objets en verre ( pipettes, baguettes de verre...), pour certains objets en métal (anse , pince), ne convient pas pour le plastique, les objets tranchants, les instruments de chirurgie délicats ...
- Emballer le matériel dans du papier aluminium, les récipients et tubes à col doivent être bouchés avec du coton cardé
- Les spores et germes sont détruits en chaleur sèche, par un chauffage de : 4 heures à 140 °C ; 2 heures 30 à 160°C ; 30 min à 180°C
- A utiliser pour la verrerie, porcelaine et instruments métalliques ( indispensable pour les parties des objets qui ne peuvent pas être atteintes par la flamme )
- Ne convient pas pour les objets en matière plastique ou caoutchouc ou objets délicats.
II / Chaleur humide ( dénaturation des protéines ) :
- Dans une atmosphère de vapeur d'eau exempte d'air, toutes les bactéries y compris les spores sont tuées en 20 min à 121°C. Pour un volume donné, la température est fonction de la pression ; on obtient la température requise de 120°C, très supérieure à la température normale d'ébullition de l'eau, en chauffant en surpression, c'est à dire en vase clos. L'appareil utilisé est l'autoclave.
- La préparation du matériel se fait selon l'indication du fournisseur de l'autoclave, à savoir de façon générale que la verrerie sera bouchée au coton et recouvert de papier aluminium, les récipients contenant un milieu de culture seront remplis aux 3/4, les instruments métalliques sont déposés sur un plateau de boites spéciales contenant une solution de carbonate de soude à 2% contre la rouille ...
- Ne convient pas pour les produits liquides délicats ( milieux albumineux, lait, gélatine ... )
- A utiliser pour les milieux de culture, matériel en caoutchouc, la verrerie, les instruments de prélèvement et la stérilisation du matériel après son utilisation.
- Un chauffage de 30 minutes à 100°C par ébullition ou un maintien dans la vapeur d'eau bouillante suffit à détruire toutes les formes végétatives. Dans ces conditions les spores ne sont pas détruites : on peut améliorer à ce moment là l'efficacité de l'ébullition en ajoutant à l'eau des solutions salines concentrées ( augmentation du point d'ébullition ) ou en prolongeant le chauffage.
- A utiliser pour la stérilisation des produits liquides délicats : milieux albumineux, lait, gélatine, solutions concentrées de glucides, ...
III / Pasteurisation et tyndallisation :
- Conservation des produits naturels pendant un temps limité, ne détruit que les formes végétatives mais pas les spores.
- Le liquide est porté rapidement à 90°C pendant 30s, par exemple,puis on le refroidit brusquement à 10°C.
- Conservation des produits alimentaires
- Chauffage à 70°-100°C à plusieurs reprises ( 1 heure tous les jours pendant 3 jours ) dans un bain marie thermostaté.
- Utilisation très limitée aux substances thermolabiles non filtrables (émulsion de jaune d'oeuf, vaccins), préparation de milieux à base de sérum ou de jaune d'oeuf.
B/ Stérilisation par filtration:
Plusieurs types de filtration existe :
- les bougies de type Chamberland : tubes à fond arrondi dont les parois sont poreuses, en porcelaine. la dimension de ces pores varie de quelques µm au 1/10 ème de µm.
- disques : disques en verre fritté de porosité de 150 à 1 µm.
- membranes : membranes plastiques minces comportant des millions de pores par cm2 dont la taille, très uniforme, varie de 8 à 0.01 µm et occupant environ 80% du volume du filtre.En bactériologie, on utilise surtout les filtres de 47 mm de diamètre dont les pores 0.45 µm de diamètre retiennent à peu près tous les microorganismes en dehors des virus.
Stériliser des liquides altérables par la chaleur : sérums, solutions hydrolysables, solutions glucidiques, vitamines ...
C/ Action des agents chimiques :
L'emploi d'agents chimiques vise la destruction d'espèces bactériennes déterminées au sein d'une flore poly-microbienne.
I / Antiseptiques
- Tuent les cellules vivantes, microorganismes et autres. Leur action est quasi instantannée. Ils agissent à l'intérieur de l'organisme ou à sa surface : teinture d'iode, mercryl laurylé, permanganate de potassium, eau oxygénée ...
- Utilisation locale chez les êtres vivants, au niveau des plaies et des muqueuses
II / Désinfectants
- Empêche les contaminations humaines et animales
- vapeurs ( formol, gaz sulfureux, oxyde d'éthylène )
- liquides ( phénols, sulfate de cuivre, de fer, eau de Javel, permangante de potassium )
- solide ( chaux vive )
- Utiliser pour tous les milieux extérieurs à l'Homme : eau, air, sol ( objets inanimés, désinfection du matériel plastique utilisé en microbiologie )
III / Antibiotiques
Substances d'origine naturelle ou obtenues par synthèse chimique.
On distingue :
- les antibiotiques bactériostatiques qui stoppent la multiplication des bactéries sans les détruire
- les antibiotiques bactéricides qui tuent les bactéries
Utilisation in vivo.
D/ Action des radiations :
- C'est la lumière U.V qui est le plus souvent utilisée ( lampes germicides ou stérilampes ) : stérilisation des surfaces et de l'air ambiant, dans des locaux ou des hottes, servant aux manipulations en atmosphère stérile ( hottes à flux laminaire ).
- Utilisation en virologie, cultures cellulaires, préparation et conditionnement des produits pharmaceutiques, ensemencements bactériens, préparation de milieux. L'irradiation précède et suit la manipulation.
- Les rayons X ou y sont utilisés pour la conservation de certains produits alimentaires.
TECHNIQUES D'ENSEMENCEMENT
L’ensemencement consiste à déposer dans un milieu neuf des germes prélevés dans un milieu de culture mère. Le transport est en général effectué avec une anse ou une pipette Pasteur.
1 / Ensemencement avec une anse:
- prendre les précautions nécessaires pour travailler dans de bonnes conditions d’aseptie
( nettoyage paillasse, mains ... )
- veiller à travailler dans la zone stérile autour du bec Bunsen
- tenir le tube contenant la culture mère dans la main gauche, déboucher près de la flamme et garder le coton dans la main.
- flamber l’ouverture du tube.
- stériliser l’anse en la portant au rouge dans la flamme du bec Bunsen, la laisser refroidir dans la zone stérile.
- prélever et repiquer rapidement dans le tube contenant le milieu de repiquage :
. repiquage dans un milieu liquide : repiquer ce qui est prélevé à l’intérieur de la boucle
. repiquage sur milieu solide : repiquer en déplaçant en zig zag l’aiguille sur la surface de l’agar, du fond du tube vers l’ouverture, en prenant soin de ne pas érafler la gélose
- repasser dans la flamme l’aiguille à ensemencer en la portant au rouge. L’aiguille est prête pour un nouvel ensemencement .
- flamber l’ouverture des tubes, flamber légèrement les cotons, boucher.
2 / Technique d'ensemencement avec la pipette Pasteur :
Les manipulations se différencient des précédentes par quelques détails :
- la pipette est passée rapidement
dans la flamme.
- l'effilure est cassée à la pince dans la zone stérile.
- on aspire les bouillons de culture ( éviter que le bouillon de culture souille le coton, danger d'infection pour le manipulateur, pas plus que la salive du manipulateur, danger d'infection pour la culture )
- on souffle pour ensemencer dans le tube stérile.
- la pipette ne sert qu'une fois.
TECHNIQUES D'ISOLEMENT
Pour étudier les microorganismes, il est indispensable de les isoler et d'en faire une culture pure. Deux techniques sont alors utilisées :
- la méthode des stries
- la méthode des dilutions
1 / Méthode des stries :
Cas d'un ensemencement en surface à partir d'un prélèvement liquide ou solide :
- prendre les précautions habituelles pour un ensemencement ( n'ouvrir que le temps nécessaire à l'exécution des stries et n'entrebailler alors la boite que devant un bec Bunsen )
- porter l'anse au rouge dans la flamme du bec, la laisser refroidir dans la zone stérile et avec l'autre main entrouvrir la boite de culture ( solide ) ou le tube ( liquide )
- prélever une colonie ou une goutte de suspension avec l'anse, refermer la boite ou le tube et prendre la boite vierge
- ensemencer de la façon suivante :
- partir de 1 en ensemençant selon le sens des flèches jusque vers 2. Flamber l'anse, la laisser refroidir et repartir perpendiculairement à la direction précédente 1-2 jusque vers 3.
- les boites de Pétri sont mises en position renversée à l'étuve à 30°C. Observer après 24 à 48 heures selon le cas ( la position renversée permet à l'eau de condensation de s'évaporer ).
2 / Méthode des dilutions :
Cas d'un ensemencement en surface par étalement d'un milieu liquide :
Cette technique permet, après un étalement sur milieu solide, d'évaluer le nombre de colonies par ml de suspension. Elle peut permettre également, si l'on ne dispose pas de lame à numération, la détermination du nombre de cellules par unité de volume ou du nombre de cellules présentes dans une colonie.
- les dilutions sont faites dans de l'eau distillée ou dans un liquide physiologique de type Ringer
- numéroter des tubes à essai de 1 à 10, chaque tube contient 1 ml de liquide de dilution
- dans le tube 1, à l'aide d'une pipette stérile, ajouter 0.1 ml de la suspension fournie, rincer la pipette trois fois.
- homogénéiser par aspirations successives et souffler la dilution 1, en prélever 0.1 ml et verser dans le tube 2. Ainsi de suite jusqu'à l'obtention de la dilution n°10.
- fabrication de l'étaloir en verre :
-
à la flamme d'un bec Bunsen, plier la partie capillaire à
environ la moitié de sa longueur de façon à en faire
un angle de 120°
- procéder de même pour plier à la moitié le segment précédent de façon à ce qu'il fasse un angle aigu
- replier de la même façon l'extrémité vers le haut sur un demi centimètre environ
- l'étaloir est maintenu dans un flacon d'alcool
- déposer sur une boite de Pétri contenant un milieu nutritif gélosé, 0.1 ml de chacune des dilutions indiquées
- étaler avec l'étaloir de façon uniforme par un mouvement de balayage et de rotation sur l'ensemble de la surface de la gélose ( ne pas ratisser la surface de la gélose ).
- laisser sécher les boites 10 min, les déposer ensuite à l'étuve, après les avoir retournées, observer 24 heures plus tard.
- compter les colonies apparues aux dilutions de 3-300 colonies, faire la moyenne des chiffres obtenus en ramenant tout à la même dilution. Evaluer alors le nombre de colonies par ml de suspension donnée.