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Cycle et niveau de classe
Lycée, Première Enseignement de spécialité
Définition
La PCR (polymerase chain reaction) est une réaction biochimique de synthèse d’ADN, réalisée in vitro et de manière répétée ce qui permet d’amplifier en grande quantité un fragment d’ADN à partir d’une matrice d’ADN contenant ce fragment.
Principe de la PCR traditionnelle
L’originalité de l’approche de PCR est que :
- Les deux brins du fragment d’ADN d’intérêt sont dupliqués simultanément, si bien qu’à l’issue d’un cycle de synthèse, le nombre de copies du fragment qui fait l’objet de l’amplification est multiplié par deux.
- Le processus de synthèse de l’ADN est répété plusieurs fois successivement ce qui permet, comme il y a duplication de l’ADN à l’issue de chaque cycle de synthèse, l’amplification exponentielle de l’ADN.
Les étapes de la réaction de PCR :
Une réaction de PCR se déroule par répétition successives des trois étapes suivantes :
1. Dénaturation de la matrice d’ADN (94°C, 30 secondes)
2. Hybridation de la matrice avec les amorces (la température d’hybridation est à définir au cas par cas, 30 secondes)
3. Polymérisation de l’ADN à partir des amorces et à l’image de la matrice (72°C, entre 30 secondes et 5 minutes selon la longueur du fragment qui est amplifié.
• Les amorces. La PCR consiste en une polymérisation par une ADN polymérase. Comme l'ADN polymérase a toujours besoin d'amorces pour commencer la polymérisation, l'expérimentateur apporte deux amorces (une pour chaque brin), ce qui permet 'imposer le site de début de la polymérisation. Si l'amorce est suffisamment longue (typiquement, une vingtaine de nucléotides), sa spécificité est absolue (i.e. aucune autre ́ séquence du génome ne peut avoir la même séquence).
• Le cycle de polymérisation : La PCR est une réaction en chaîne, qui suit un cycle. A chaque cycle, l'ADN est dénaturé́ a ̀ 95°C, puis refroidi a ̀ 55°C. Les amorces peuvent se fixer. La polymérase effectue l'élongation, a ̀ l'issue de laquelle un nouveau cycle peut commencer. Chaque cycle multiplie le nombre de molécules d'ADN par 2. Au bout de 30 cycles, soit environ 2h, on a donc 230 = 109 molécules d'ADN.
• La polymérisation : Les polymérases de la plupart des organismes seraient dégradées par les hautes températures (pourtant nécessaires a ̀ la dénaturation de l'ADN) auxquelles elles seraient soumises lors de la PCR. L'originalité ́ de la PCR est l'utilisation d'une polymérase extraite d'une bactérie vivant dans des sources thermales très chaudes, Thermus aquaticus (d'ou ̀ le nom Taq-polymeŕ ase).
Cet enchaînement d’étapes qui constitue un cycle d’amplification est reproduit successivement de 20 à 50 fois.
Schéma d'un cycle d'amplification